２００６Ｄ。ｃｔｏｔａｌ Ｆ。吣ｏｆＣｈｉｎａ 中国沙棘子叶原生质体游离及其膜片钳 全细胞记实探讨初报 （北京林业大学生物科学与技巧学院，北京１０００８３）摘要：初度报道了适合膜片钳实行的耐盐木本植物中国沙棘子叶原生质体的游离条目，即取当天脱壳的子叶，放入 渗出势为Ｏ．８８Ｍ，ｐＨ为５．８，酶液组分为１．０％ｃｅｌｈｉｌａｓｅ Ｒ－ＩＯ、０．０５％Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ－２３、０．１５％ＭａｃｒｏｚｙｍｅＲ－１０、Ｏ．１％ Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ、０．１％ＢＳＡ、Ｏ．１％ＰＶＰ－４０、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ ｍＭ Ｍｅｓ和５ ｍＭ Ｖｃ的溶液中，正在２６、昏暗条目下，静 置４ｈ。而且行使Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ放大器和Ｃｌａｍｐｃｘ ９．２软件，记实到了该原生质体质膜全细胞内向Ｋ＋通道电流 （－４５９．１３７ｐＡ及－２９０．５２７ｐＡ）和非拣选性阳离子通道的表向电流（８．０３６ｐＡ）。其它，咱们展现荧光增白剂ＶＢＬ可用于 阅览原生质体皮相残剩的细胞壁，并用于判定原生质体质膜能否与玻璃微电极管尖端变成高阻封接，条件是原生质 体质膜未受到紧张毁伤。这为沙棘属木本植物细胞电心理个性及其耐盐机造相合的探讨奠定了本原。 合节词；中国沙棘。子叶，原生质体，游离，膜片钳，Ｋ＋通道，非拣选性阳离子通道，全细胞记实 Ｚｈｕ Ｊｕｎｙｉｎｇ；Ｙａｎ Ｈｕｉ；Ｙｉｎ Ｗｅｉｌｕｎ；Ｇａｏ Ｒｏｎｇｆｕ．Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｈｏｌａｆｉｏｎ ｐａｔｃｈｃｌａｍｐ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙ ＵｎｉｗｒｓｉｔｙＢｅｉｊｉｎｇ，１０００８３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｅｄｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅｔａｋｅｎ ｏｆｆｔｈｅ ｓｅｅｄ ｏｕｔｅｒ ｃｏｖｅｒｉｎｇ ｓａｍｅｃｌａｙ ４ｈｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｄａｒｋｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２６＂Ｃ．Ｔｈｅａｌｚ），ｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｓ Ｏ．８８Ｍ Ｄ－ｍａｎｎｉｔｏｌ，５ ｍＭ Ｖｃ，２ｍＭ ＣａＣｌ２， １０ ｍＭ Ｍｅｓ，Ｏ．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，Ｏ．１％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ－４０，１．Ｏ％（ｗ／ｖ）Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｒ－１０，０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ－２３， ０．１５％（ｗ／ｖ）ＭａｃｒｏｚｙｍｅＲ－１０，Ｏ．１％（ｗ／ｖ）Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ（ｐＨ ５．８１．Ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｓｔｕｄｙＫ＋ｃｈａｎｎｅｌｓ ｃｕｒｒｅｎｔｓ（－４５９．１３７ ｐＡ ａｎｄ－２９０．５２７ｐＡ）ａｎｄ ｎｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｃｕｒｒｅｎｔｓ（８．０３６ ｐＡ）ｉｎ Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｃｅｌｌｓ ｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ Ｃｌａｍｐｅｘ９．２ ｓｏｆｔｗａｒｅ） ｆｉｒｓｔｔｉｍｅ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙｗｅ ｆｏｕｎｄ ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒｗｈｉｔｅ ＶＢＬ ｍａｙ ｕｓｅ ｃｅｌｌｗａｌｌ ｒｅｍａｉｎｅｄ Ｏｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌｓｓｔＳｌＬｒｆａｃｅ，ｂｅｃａｕｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｙｅ ｒｅａｃｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｅａｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ｗｈｅｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｐｒｏｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｈａｓ ｓｅｒｉｏｕｓｄａｍａｇｅ．ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｓｅｅｍｓ ａｐｐｒａｉｓａｌｇｉｇａ－ｓｅａｌｓ ｂｃｔｗｏｃｎ ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｒａｓｓｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｏｆｆｅｒｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｃｅｌｌｕａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｗｏｏｄｙｐｌａｎｔ ｓｅａｂｕｃｋｔｈｏｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ Ｌ．，ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ。ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐ，Ｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ，ｎｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ，ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ 自从１９８４年，膜片钳技巧初度行使于草本植物原生质体质膜离子通道【１、２１的探讨后，人们对离子通 道正在植物体内的心理效用越来越感趣味。跟着对草本植物细胞离子通道性能探讨的逐渐深远，人们已明 确地舆解到离子通道及其活性调控正在植物细胞一系列性命举动经过中的紧急效用，而且以为离子通道正在 第一作家：朱俊英，女，江西宜丰人，副教练。首要探讨宗旨：植物电心理、窘境心理生化。电线，。Ｅｍａｉｈ ｚｈｕｊｕｎｙｉｎ＃）５１３＠ｓｏｈｕ．娜地方：１０００８３北京林业大学生物科学与技巧学院． ｔ义务作家：高荣孚，教练，博士生导师。首要探讨宗旨：植物心理．电线；尹伟伦，教练，博士生导师。首要探讨宗旨：植物 心理．电线北京林业大学生物科学与技巧学院。 １２５０ ｌＢｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２００６年寰宇博士生学术论坛 草本植物细胞盐符合机造中起了必然的效用【３￣６１。相合木本植物离子通道的探讨尚不多见。 中国沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ Ｌ．）一名醋柳、胡颓子科、沙棘属、落叶灌木或幼乔木。普及漫衍于 西北、华北、东北和西南的少少省区，生态符合幅度较广，既可正在腐蚀激烈的干旱阴坡上成长，也可正在 泥土含水量达４０．６％的山地草甸土上成长；既能正在．４０＂Ｃ的高寒山区存活，也能正在ｐＨ９．１和含盐量１．１％的 盐碱土上平常成长【７１。对中国沙棘耐盐个性仅对耐盐碱种类的筛选及其抗盐性的凡是心理目标做了发端 探讨。相合沙棘属植物的原生质体膜片钳探讨尚未见到报道。 膜片钳技巧正在草本植物上的探讨讲明，区别植物体或统一植物体的区别机合器官的原生质体的游离 条目不同很大，如酶基液组分、酶液渗出势、酶解年光、酶解温度等方面ｆ８￣１２１。因而，本文搜求了中国 沙棘子叶原生质体高产量、高生机的游离条目，适合膜片钳封接的原生质体的游离条目，并用荧光增白 剂ＶＢＬ阅览原生质体皮相细胞壁等实行了探讨，为其离子通道的电心理个性与耐盐特质实行深远探讨 打下了本原。 １质料与设施 １．１质料提拔 中国沙棘种子先用７０％乙醇皮相消毒，再用３０％的Ｈ２０２处分。于２５＂Ｃ、昏暗条目浸种催芽，用 １／１０ Ｈｏａｇｌａｎｄ提拔液（光／暗周期为１２ｈ／１２ｈ，２４。Ｃ士１＊Ｃ／１９＂Ｃ＋１，光强度为１４４１ａｍｏｌ ｍ－２．Ｓ一，相对湿度 ６０％）中提拔。 １．２原生质体游离 取当天脱去种子表壳的子叶０．１９实行原生质体游离，去表皮，切成幼块，放入幼烧杯内，参加ｌｍＬ 必然渗出势的ＣＰＷ［１３１或ＳＥ溶液嘲配造的酶液（含１．Ｏ％ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｒ．１０、Ｏ．Ｉ％ＢＳＡ、０．０５％Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ－２３、 ０．１５％ＭａｃｒｏｚｙｍｅＲ．１０、０．Ｉ％ＰＶＰ．４０和０．１％Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ｐＨ ５．８），正在２６、昏暗下，静置一段年光， 用３００目尼龙过滤，用洗液（表１）冲刷后，于２００ｘｇ离一ｔ］５ｍｉｎ，弃上清液，再用洗液洗涤、离心２次， 终末原生质体悬浮于洗液中，冰浴留存备用。 表１比照溶液成份 ＴＡＢＬＥ ｌＳｔａｎｄａｒｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｋ－Ｇｌｕ Ｎａ—Ｇｌｕ ＮａＣＩ ＫＣＩ ＣａＣｌｚ ＭｇＣｌ２ Ｈｅｐｅｓ Ｍｅｓ ＥＧＴＡ Ｍ９２ ＡＴＰ ｐＨ 渗出势 洗液。 ｌＯ ｌ２５５．８ ８７８ 胞表溶液１ １０ １４５５．８ ８７８ 胞内溶液１ ９８ ２２１０ ２４７．２ ９３３ 洗液２ ｌＯ ｌＯ ２２５．８ ８７８ 胞表溶液２ ０．５ ２５．８ ８７８ 胞内溶液２ ２５ ５１０ ４７．２ ９３３ 注：表中溶液浓度单元为ｍＭ；１为测Ｋ＋通道电流的溶液；２为测菲拣选性阳离子通道电流的溶液１１”；Ｋ—Ｇｌｕ为谷氨酸钾；Ｎａ－Ｇｌｕ为谷氨酸钠 １．４原生质体产量和生机的测定 将征接纳得的原生质体（图版Ｔ Ａ），用荧光素双醋酸酯（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）法【１２】或伊文斯 兰染色法ｆ１４】（见图版ｌ Ｂ），滴加正在血球计数板上计数、算生产量和生机。 １．５电极修造 拣选内径为０．９ｍｍ、表径为１．Ｓｍｍ的硼硅酸有芯玻璃毛细管，正在拉造仪（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ ＰＰ－８３０，Ｊａｐａｎ） 上采用两步法（Ｈｅａｔｅｒ ｌ大致为６５．０，Ｈｅａｔｅｒ ２大致为４８．０）拉造，并正在热扔光仪（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ ＭＦ．８３０，Ｊａｐａｎ） 进步行扔光。造成的微电极尖端内径常常为１岬安排，电极电阻为１０ Ｍｆｚ～２０ ＭＱ。 １．６膜片钳全细胞记实经过 样品池内参加ｌｍＬ胞表溶液（见表１），摄取冰浴留存ｌｈ后的原生质体悬浮液１０灿参加样品池， 北京林业大学Ｉ １２５１ ２００６ Ｄ。ｃｔｏｔａｌ Ｆ。ｒｕｍ。ｆ Ｃｈｉｎａ 静置１０ｍｉｎ，使原生质体与样品池玻璃薄片贴壁。采用Ｈａｍｉｌｌ等【ｌ ５】的设施实行膜片钳全细胞记实。正在倒 置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１）下，拣选细胞质清爽、质膜腻滑的原生质体用于记实。测试时维持电位为．６０ｍＶ， 阶跃指令电位从．１８０ ｍＶ入手下手逐级递升至Ｕ＋８０ ｍＶ，每级为＋２０ ｍＶ。本实行运用Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ的电流 放大器、前置放大器、信号接口和软件。 １．７荧光增白剂染色和阅览 将荧光增白剂ＶＢＬ溶于渗出势为Ｏ．８８Ｍ甘露醇（ｐＨ７．０）的溶液中，浓度为Ｏ．１％。 称取纤维素粉（自造）２０毫克，溶于１０ｒａＬｐＨ７．０的去离子水中，取５ｍＬ，用Ｏ．１％的荧光增白剂 ＶＢＬ染色５ｍｉｒａ其它５ｍＬ不染色。终末分裂于载玻片上偶然压片，于波长３３０．３８５ｎｍ紫光的荧光显微 镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１）下阅览、摄像，不发蓝色荧光的为未染色的纤维素粉（图版Ｉ Ｃ左），发蓝色荧光 的为ＶＢＬ染色的纤维素粉（图版Ｉ 将冰浴留存的原生质体，用０．１％的荧光增白剂ＶＢＬ染色５ｒａｉｎ，用０．８７８Ｍ洗液洗３、４次，于载玻片上偶然压片，终末于波长３３０．３８５ｎｍ紫光的荧光显微镜下阅览、摄像，原生质体皮相无蓝色荧光（图 ｄ），注解该原生质体皮相没有细胞壁残剩，原生质体皮相有蓝色荧光（图版Ｉｅ、ｆ），注解该原生质 体皮相有细胞壁残剩。 ２结果与阐述 ２．１酶液渗出势对原生质体产量和生机的影响 酶液中其他因素沟通，通过２ｈ酶解后，对比了甘露醇浓度由 Ｏ．７ｌＭ、０．７７Ｍ、０．８２Ｍ、０．８８Ｍ和０．９３Ｍ ５种区别渗出势的酶液对 中国沙棘子叶原生质体的游离成就。结果讲明（图１），跟着渗出势 的增大，原生质体产量和生机都呈上升趋向，正在甘露醇浓度为０．８８Ｍ 时，原生质体产量和生机都到达岑岭，产量为８．７９１０６个．ｇ－ＩＦＷ一， 生机为８７．６％，可是渗出势太高也倒霉于原生质体的游离，Ｏ．９３Ｍ 时原生质体产量仅为０．３９１０６个 ｇ。１Ｆ、矿１，生机也低落。因而下 面的实行都采用渗出势为０．８８Ｍ的酶液实行。 ２．２酶基液因素对原生质体产量、生机的影响 ：口原生质体 。口原生质体 ７１Ｍ０．７７Ｍ ０．８２Ｍ ０８８Ｍ ０．９３Ｍ 图１不问渗出势酶液对沙棘子叶原生质体产量 和生机的影响 ＦＩＧＵＲＥ ｌＴｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｍｎｎｉｔｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｙｉｅｌｄ游离原生质体的酶基液不尽沟通。关于许多做原生质体提拔【１３】脚啪加８础蚴。７加。。‘７１。‰ｐｒ０‘。９１８８‘８ 的，他们都用ＣＰＷ液为酶基液来游离原生质体，而关于做膜片钳实行的原生质体游离的酶基因素也不 相通，并且多人是采用Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ等人ｉｓ］的酶基因素，本文把Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ 等人的酶基液定名为ＳＥ。正在沟通酶解条目（２８，静置２ｈ）及沟通酶成 分下，对比了区别酶基因素对中国沙棘子叶原生质体产量和生机的影响。 由图２可知，ＳＥ为酶基时得到的原生质体产量清楚高于ＣＰＷ的，而原 生质体的生机相通。因而下面的实行都采用ＳＥ酶基实行。 ２．３酶解年光对原生质体产量、生机的影响 正在沟通酶解条目（温度为２６，静置）下，于区别酶解年光实行镜 检，展现ｌｈ后有少量原生质体游离出来，跟着年光的延伸，原生质体的 数目渐渐加添，７ｈ原生质体产量到达最高，约为１１．３１０ ｇ－１Ｆｗｌ。９ｈ后原生质体产量不再加添，而是低落，因为是有生机的原生质体大部 分变形、碎裂，完善的原生质体数目淘汰，原生质体的碎片明显加添。 到２３ｈ时原生质体的产量和生机都很低。２６下，酶解７ｈ，沙棘子叶原 生质体产量固然到达最高，但原生质体质膜长年光闪现于酶液中，使得 质膜受到毁伤以及容易沾上溶液中的细胞碎片，而倒霉于膜片钳实行。 １２５２ ＩＢｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＾ＩＶ穴蝗垃蜓刊匿１２０ ａ原生质体生机 挂蜒酬蜡ＣＰＷＳＥ酶基液名称 图２区别酶基液对沙棘子叶原生质体 产量和生机的影响 ＦｌＧＵＲＥ ２Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｎｚｙｍｅ－ｂａｓｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ． ＣＰＷ（ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０ １４８０ ｍｇ／ｔ， ＫＨ２Ｐ０４ ２７．２ｍｇ／Ｌ，ＫＮ０３ １０１ ｍｇ／Ｌ， ＭｇＳ０４＂７Ｈ２０ ２４６ ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳ０４’５Ｈ２０ ０．０２５ ｍｇ／Ｌ，Ｋ１ ０．１６ ｍｇ／Ｌ，５ｍＭ Ｍｅｓ）． ＳＥ ｆｌＯｍＭ Ｍｅｓ，２ｍＭ ＣａＣｌｚ） ２００６年寰宇博士生学术论坛因而，下面进一步商讨了区别温度对原生质体产量和生机的影响。 原生质体生机 原生质体产量 ］１４ 喙９ｈＩｌｈ ２３ｈ年光（ｈ） 图３区别酶解年光对沙棘子叶原生质体产量和生机的影响 ＦＩＧＵＲＥ ３Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｖｒｏｔｏｏｌａｓｔｓ ２０＂（２２２２４＂Ｃ ２６２８＂（２ ３０温度 图４区别温度对沙棘原牛质体产量和生机的影响 ＦＩＧＵＲＥ ４Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ Ｄｒｏｔ００１ａｓｔｓ ２．４酶解温度对原生质体产量、生机的影响 图４为区别温度下，静置２ｈ后，离心征采的沙棘子叶原生质体的产量和生机。从图４可能看出， 跟着温度的上升，原生质的产量也加添，可是，正在２４～３０温度限度，原生质体的产量增幅不明显。 注解酶活性正在２４～３０＂Ｃ温度下较高，能充足酶解细胞壁，不同不是太大。 跟着酶解温度的上升，原生质生机出现为低落，并且，跟着温度的上升，２８～３０时，细胞碎片 也清楚增加。因而，统筹研商原生质体的产量、生机和酶解经过中产尘的细胞碎片的量，酶解温度以２６ ＋４０ｍＶ ＱｕｉｃｋＩ－Ｖ －４００．４００ ００５１Ｔｗｌｌｅ ｒ０１ ＶｐＡ０ 百ｉ０ 。州、／ｈＡＬ２歹ｅｖ＇ｅｌ《－２ －１００ ８ｈ！／ ．２００兰 磊图５中国沙棘子叶叶肉细胞内向Ｋ＋通道电流全细胞记实ＦＩＧＵＲＥ ５Ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ（Ａ．Ｂ）．Ｔｈｅ ｖｏｌｔａｇｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｍｅａｎｃｕｒｒｅｎｔ－ｖｏｌｔａｇｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｈｏｌｅ—ｃｅｌｌｃｕｒｒｅｎｔｓ． 圈６沙棘子叶叶肉细胞非拣选性阳离子通道电流全细胞记实及其全细胞跨膜电流与电压 相合弧线Ｔｈｅ ＮＳＣＣ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ（Ｃ）．Ｃ’ａｌｅ ｃｕｒｒｅｎｔ—ｖｏｌｔａｇｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆＮＳＣＣ ｃｕｒｒｅｎｔｓ． 安排为宜。 ２．５全细胞内向Ｋ＋通道和非拣选性阳 离子通道电流的记实 中国沙棘子叶叶肉细胞原生质体 正在胞表溶液含１０ｍＭ Ｋ．Ｇｌｕ＇１ ｍＭ ＣａＣｌ２、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ ｍＭ Ｍｅｓ，胞内 溶液含９８ｍＭ Ｋ．Ｇｌｕ、２ｍＭ ＫＣｌ、ｌ ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２和１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ 时，维持电位设正在．６０ｍＶ，当膜电位超 过．２０ ｍＶ时，可记实到清楚的内向电 流，膜电位越负则内向电流越大（图 ５），正在一１８０ｍＶ时，有的原生质体质膜 电流为．４５９．１３７ｐＡ（图５．Ａ），有的电 流值为．２９０．５２７ｐＡ（图５．Ｂ）。注解中 国沙棘子叶中存正在电流巨细纷歧的内 向Ｋ＋通道，或许保障子叶细胞对Ｋ＋的 汲取，从而维持胞质Ｋ＋浓度相对较高， 关于植物的成长及耐盐性都吵嘴常必 ６Ｊ：当胞表溶液含２ｍＭ Ｍｅｓ、 ０．５ｍＭ ＣａＣｌ２，胞内溶液含２５ ｍＭ Ｇｌｕ．Ｎａ、５ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＥＧＴＡ、５ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ时，有微细的表向电流，最 大值为８．０３６ｐＡ（图６）。注解中国沙棘 北京林业大学Ｉ １２５３ ２００６Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｆｏｒｕｍ Ｃｈｉｎａ子叶细胞胞质中Ｎａ＋浓度高时，片面Ｎａ＋可通过非拣选性阳离子通道表排。 ２．６荧光显微镜阅览原生质体皮相残剩细胞壁 正在光学显微镜下阅览游离取得的中国沙棘子叶的原生质体，表观样子都对比腻滑、充分，可是，当 用于膜片钳实行时，却不行知足长年光记实，有时以至不行变成高阻封接。于是，咱们对区别酶液组分、 酶基液、酶解年光以及酶解温度取得的原生质体实行了膜片钳实行的高阻封接得胜率及其质膜皮相残剩 细胞壁的荧光阅览（表２）。结果讲明，正在区别酶解温度、区别酶基液和区别酶液组分下，取得的原生质 体与微电极高阻封接的得胜率与质膜皮相不发荧光比率呈正干系相合，即酶解温度为２６、酶基液为 ＣＰＷ以及酶液中增加Ｖｃ时，膜片钳实行的高阻封接得胜比率与质膜皮相不发荧光比率都较高。质膜表 面不发荧光也即是说质膜皮相没有细胞壁残剩，如许的原生质体质膜才具与微电极变成高阻封接。 表２区别酶解条目对原生质体膜片钳高阻封接得胜比率和质膜皮相不发荧光比率的影响 处分酶解温度（） 酶解年光（ｒａｉｎ） 酶液组分Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ２０ ２４ ２６ ３０ ５０ ８０ １１０ １８０ ＳＥ ＣＰＷ 有Ｖｃ 无Ｖｃ 赢阻封接得胜率比率（％）０ ４２。９ ５６ ２５ ７０ ６０ １０ ０１２，５ １４。８ ２５ １６．７ 质膜皮相不发荧光比率（％） １０ ５６．８ ６６．７ ３２．６ ３３．３ ４６．２ ４６．２ ５３．８ ５３．８ ７１．４ ４０ ３７．５ 但区别酶解年光取得的原生质体，其膜片钳实行的高阻封接得胜比率与质膜皮相不发荧光比率并不 展示正干系相合。跟着酶解年光的延伸，原生质体与微电极变成高阻封接的得胜比率低落，而原生质体 皮相不发荧光比率却上升。这大概是由于酶解年光长，一方面，细胞壁消化更彻底，多半原生质体皮相 没有残剩的细胞壁，因而，原生质体皮相不发荧光比率高。另一方面，大概导致质膜受毁伤加剧，原生 质体生机低落，进而导致原生质体与微电极变成高阻封接的得胜比率快速低落。 ‘由此注解，荧光增白剂ＶＢＬ可用于阅览原生质体皮相残剩的细胞壁，正在原生质体质膜未受到紧张 毁伤时，可动作判定原生质体能否变成高阻封接的间接伎俩。可是，原生质体能否与微电极变成高阻封 接，并不单仅取决于原生质体皮相无细胞壁，大概还与原生质体的生机、质膜的心理状况相合。 ３结论与研究 本探讨以耐盐木本植物中国沙棘为试材，探讨了区别酶基液组分、酶液渗出势、酶解年光和酶解温 度对其子叶原生质体的产量和生机的影响，以为以ＳＥ为酶基液、渗出势为ｏ．８８Ｍ、酶解年光为７ｈ以及 酶解温度正在２４－＇一２６时，得到的原生质体的产量和生机都较理思。 正在此本原上咱们进一步考查了适合膜片钳实行的原生质体的最佳游离条目，并行使Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ 放大器和Ｃｌａｍｐｃｘ ９．２软件，记实到了该原生质体质膜全细胞内向Ｋ＋通道电流（－４５９．１３７ ｐＡ及 一２９０．５２７ｐＡ），注解子叶中存正在电流巨细纷歧的内向Ｋ＋通道，或许保障子叶细胞对Ｋ十的汲取，从而维持 胞质Ｋ＋浓度相对较高；同时，还记实到了非拣选性阳离子通道电流（８．０３６ ｐＡ），注解子叶细胞胞质中 片面Ｎａ＋可通过非拣选性阳离子通道表排，这两种通道的存正在，关于中国沙棘的成长及耐盐性都吵嘴常 须要的。因而，目前，咱们基础修造了耐盐木本植物中国沙棘的膜片钳实行技巧，以为适合膜片钳实行 的子叶原生质体的最佳游离条目是：取当天脱壳的子叶，放入渗出势为０．８８Ｍ，ｐＨ为５．８，酶液组分为 １．０％ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｒ一１０、０．０５％Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ－２３、Ｏ．Ｉ％ＢＳＡ、Ｏ．１５％ＭａｃｒｏｚｙｍｅＲ一１０、Ｏ．１％Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ、 ０．１％ＰＶＰ－４０、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ ｍＭ Ｍｅｓ和５ ｍＭ Ｖｃ的溶液中，正在２６、昏暗条目下，静置４ｈ。 因为上述条目下得到的原生质体不行知足长年光记实，咱们又对区别处分取得的原生质体，实行了 膜片钳实行的高阻封接得胜比率与质膜皮相残剩细胞壁的荧光阅览（表２）。咱们展现，荧光增白剂ＶＢＬ 可用于阅览原生质体皮相残剩的细胞壁，当原生质体皮相有细胞壁残剩时，原生质体皮相就会发出蓝色 荧光（图版Ｉ ｅ、ｆ），没有细胞壁残剩时，原生质体皮相就不发出蓝色荧光（图版Ｉ ｄ）。并且，正在必然酶 １２５４ ＩＢｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｃｓｔｒ３，Ｕｎｉｖｃｒｓｉｔｙ 解年光范闱内，酶解温度为２６＇Ｃ，酶基液为ＣＰＷ咀殷酶液中漆加ｖｃ时．膜Ｈ钳实行的离阻封接得胜比率与质膜采幼发荧光比车都较高。…此，咱们以为荧光增白剂ＶＢＬ町以用米判定原７ｔ质体能否形 成高｝且封接。然而，跟着酶解时问的延伸，娘生质体皮相幼艇荧光比率会上升．ｆｑ原生质体与微电极形 成高阻判接的得胜比串却低落，这注解原生质体能台与微电极变成高阻封接，并幼仪仪ｌ玟砍Ｊ二原生质体 皮相有无细胞壁．可臆还与原生质体的生机、质脱的心理状况干『天， 关于得到知足Ｋ时问记实的－｝】围沙棘ｒ叶的棘生质体，以肢其离了通道的电心理特盹和耐盐机造的 相合，正ｎ：提高探讨之ｃｐ。 ＿。圈圈圈固 —Ｌｍ＊ｍＦ￡ｄ＆ｆ＾ｈＦＤＡｎ”Ｅ ＊＊（ｔ１＊＊ｍｆｌＭＶＢＬ＊｝？镕《＂＆＊Ｅ＊ｆＴ ｒｋ Ｄｄ～ＦＥ＊ｍｎＨｉ｜ｎ＊女ｌｍ女ｍ，ｍ＃＃自件Ｋ《ｅ（ｄｊ‘ｌ ｆｒ）．ＤＥ＃『Ｆ＂ｍ｛＾ｔｍ＊ｍ镕＃ｍｍ’ｔ ｐＬＡＴＥＩ Ｆｉｇｈｔｍｉｃｍｇ“ａｐ＇ｎ ｏｆ呷ｐ】ｂｆｒｏｍＭ＂神ｗ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｃ叫ｌｅｄｆＡ）：Ｌｉｇｈｔｍｉｅ州ｈ ｏｆｐ”ｔｏｐ协Ｂ ｄ）ｗｉｔｈ‰ＢｌｕｅＢｌｕｅ ｆｄｃｂ＇１ ＮｔｂｌｕｅＩｖｉａｂｉｌｉｔｙＫｌｅｆｌｏｆＨ）＇Ｆ］ｕ—ｔｍｌｏｗｈ ｏｆ“ｌａｓｔ５ Ｐ肼删砌ＦＤＡ ｎｗｃｎＩ～ａａｂ）ｌｉｔｙ）ｆＴｌｐｔ ｏｆＢｋ…ｗｔ Ｊｎｌ…ｈ ｕｆ ｃ＃ＩＩｕ吣删“ｐ）ｅｔ删ｗｌｍ ｄ￣＿ｕｂｌｅ ｄｉ ｓｌｌｌｌｃｄ ｗａｔｃｒｓｈｏｗｅｄ ｂｌ＊ｎｕｏｌ—ｎｃｑＩｃｌｌ ｏｆｃ’ｗｊｍ ｃａｌ‘ｕｎｒｗｂ ｎ…ｏｆｎ咖ｏｆＣ）＝Ｌｉｇｈｔ（Ｄ协Ｆｄｎ…州ｍｍ嘶ａｐｈ ｏｆｐ”呻】“Ｂ畔咖ｋｄｗｉｌｈ ｃ蜘ｎ川ｗｈｉｌ《 ｓｈｏｗｅｄｂｌｕｅ ｎ……ｔｈｅｉ ｒｓｕｒｒ州ｓｏｌｄ）ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｌｃＩｃｍｒ ｄｏｆＩ ｏ『ｂｌｕｅ ｎ…～ｏｎｔｈｅｉｒ 参考文《 ５ｃＨＲＯＥＤＥＲＪＩｔ ＨＥＤＥＩＣＨ Ｒ－ＦＥ帅踞ＪＭ Ｐｏ‰；ｌｕｍ，ｃｌｅｃｕｖｃｍｎｇ“ａｎ嘣ｓ“ｇｕａｒｄ耐Ｉ ｐ【。ｐＩｏｆ＂自６印］黼１９ ３Ｉ＇：３６ｌ ６２ １２】ＭＯＲＡＮＮ ＥＨ旺ｓＴＥＨＧ［ＷＡＳＡ ＫＩｖｎ ｃｈ咖ｃｋｌｎ ｐｌ……ｏｆｗｈｅａｌｏＩ＂Ｉａｍ“】Ｓｃｉｅ”，ｌ ９８４．２２６：３３５ ３７ ｐＡＮＴＯＪ］ＡＯ ＤＡＩＮＴＹ ＪＢＬＵＭＬＤ Ｅ１ｌ苫Ｉ…ｃｕｏｆｒｏｍ ｌ。ｐｈｙｂ ａ“９１”。Ｐｈ忡［月ＦＥＢＳＬ…ｒ １９８９ ２５５＝９２｛ Ｈ４删＾Ｙ ＯＢＩｌ ＹＯＳＨＩＨＡＳＨＩＭ ｗａ／ｄ ｐｃ删ｄ０１］ｉｔｙＫ“ｄＮａ ｉｏｎｓｏｆＫ ｃｈａｎｎｅｌｓｉｎ恤ｐｌｍａ删ｎｂ…ｏｒｔ＊１１ ｓｉｎ 螂Ｆ“啪ａｆｔｅｒ扎口１…￥０ｍＭＮａｃｌ口］…ｐｈｊ＾，１９，５：８７．９２ １５】ＨＵＩＳ Ｆ】Ｍ－ｐＩＯＮＳＩＩ ＢＡ Ｐａｌｃｈ ｃｌａｍｐ ５ｍｄｍ ｏ…ｃｅｌｌ…ｈ ａｓｕｄａ１Ｉ ．．．．ｉｔｉｖｅ‰岵。５咩“…Ｐｌａｎｔ ，’ｋＭ １９９２：２３ｒ８ ＭＡＡＴ｜ＩＵＩＳ ＦＪＭ ＳＡＮＤＥＩｓ ＤＳｏｄｉｕｍｑｑ…ｉｎ ｍ６嘶ｍ…川”ｐｌ删ｈｙ娜ｎ ｎｕｅｌｃ订ｔｌｄｅｓＥ２］Ｐ栅ｆ＾＂ｆ ２７：】６１７．２５ ２００。：６７－７９ＬＩＡＮ ＹｓＬＵ ＳｑｘＵＥ ＳＬｄｄＴｋ ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｎｅｍｌ ｓｂｕｃｋｔｈｏｍ］ｕ＆ｎ…】ｃｎｃ…ａｎｄｌ‘ｌ】ｏｌ…ｍｌ＃ｈ。＂ ２００３；６７ ７９ １８］ＳＣ｝ｆＲＯＥＤＥＲＫ＋咖印”ｐ７。ｍ岫ｓｏｆＫ’岫ｌｓｉｎｔｈｅｐｌａｓ舳眦吣删ｍ＾ｈａ ｇｕａｒｄ ｃｅｓ口］胁ｍ啪Ｉ，１９８８ ９０＝６６７ ８３９ ＧＡＳＳＭＡＮＮＷＳＣＨＲＯＥＤＥＲＩ删ｍｃｕｑ”ｇＫ ｃｈｍｃｌｓｉｎ啪ｔｈ…１ｐｌａｎｔＰｈ）ｓｉｎ Ｉ９９４１０５；１３ｌ枷 １１０１ ＶＡＮ ＤＵＵＩＮ 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ＰｈｙｓｉｏＬ，２００２，１２８：３７９—８７ １２５６ ＩＢｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
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